Bioquímica - Aula 02- Replicação

   

           Replicação, transcrição e tradução 

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Replicação

(1) Evidência da replicação semi conservativa

Cada fita do DNA funciona como um molde para a síntese de uma nova fita, produzindo duas novas moléculas de DNA, cada uma com uma fita nova (1’ e 2’)  e uma fita velha (1 e 2) . Isso é denominado de replicação semi conservativa.

A replicação semiconservativa foi proposta por Watson e Crick e demonstrada pelo experimento de Matthew Meselson e Franklin Stahl. Meselson e Stahl imaginaram que, se as duas cadeias polinucleotídicas de uma molécula de DNA fossem marcadas, seria possível fazer uma previsão sobre o destino dessas cadeias no decorrer das gerações celulares subsequentes.

Para isso, marcaram as moléculas parentais de DNA com um isótopo pesado, mas não radioativo, o nitrogênio 15N. Fizeram isso cultivando Escherichia coli no meio de cultura como única fonte de nitrogênio disponível um sal contendo isótopo 15N. Após 14 gerações nesse meio de cultura, pôde-se prever que todo o DNA das bactérias continha 15N ao invés de 14N. As bactérias foram, então, transferidas para um meio de cultura contendo apenas a forma leve do nitrogênio, o 14N. Assim, todo o DNA sintetizado a partir desse momento, seria sintetizado com o 14N, e não mais com 15N. De acordo com a hipótese da replicação semiconservativa era previsto que, após um ciclo de replicação no novo meio de cultura (contendo apenas 14N), cada nova molécula de DNA conteria 50% de 15N e 50% de 14N; e, após dois ciclos de replicação, metade das moléculas de DNA conteria apenas 14N enquanto que a outra metade seria 50% 15N e 50% 14N, conforme podemos ver no esquema mostrado a explicação a seguir

Experimento: 

A.1 - Cultivou E.coli em um meio de cultura contendo N15

A.2 - Após várias gerações terem se desenvolvidas no meio com azoto pesado, foram transferidas para um meio com azoto normal N14. Imediatamente após a transferência, foi retirada uma amostra de onde se extraiu o DNA que foi sujeito a centrifugação

A.3 – Ao fim de 20 minutos ( tempo necessário para que estas bactérias se dividissem e dessem origem a uma nova geração), foi retirada uma amostra, extraído o DNA e centrifugado.

A.4 - Ao fim de 40 minutos, foi retirada uma nova amostra que foi sujeita ao procedimento anterior ( extração e centrifugação de DNA). 

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A distinção entre os diferentes tipos de DNA foi possível graças à técnica analítica desenvolvida por Jerome Vinograd, que ficou conhecida como centrifugação de equilíbrio em gradiente de densidade. O gradiente de densidade se forma quando uma solução de cloreto de césio é submetida a uma ultracentrifugação. O sal de césio fica distribuído em concentrações gradativamente maiores, do topo para o fundo do tubo de ensaio, de modo que a solução é mais densa no fundo e menos densa no topo. Quando moléculas são misturadas a uma solução de cloreto de césio, e essa mistura é submetida a uma ultracentrifugação, as moléculas se posicionarão no gradiente de densidade do césio, em uma faixa correspondente à sua própria densidade.

Moléculas de DNA com diferentes proporções de 14N e 15N tem densidades diferentes e, portanto, se posicionarão em regiões diferentes no tubo de ensaio de acordo com a proporção que possuírem desse elemento. O 15N é mais denso que o 14N, portanto teremos as moléculas de DNA distribuídas da seguinte maneira no tubo:

Em seu experimento, Meselson e Stahl verificaram, que:

1 – moléculas de DNA extraídas de bactérias cultivadas em meio normal com 14N formavam uma faixa na parte superior do gradiente de cloreto de césio, ou seja, tinham uma densidade relativamente baixa.
2 – O DNA extraído de bactérias cultivadas por 14 gerações em 15N, formava uma faixa na parte inferior do gradiente, isto é, tinha uma densidade relativamente alta.
3 – O DNA extraído da primeira geração produzida a partir de bacterias marcadas com 15N e cultivadas em 14N, ficavam numa posição intermediária do gradiente, entre as duas anterioes.
4 – O DNA extraído da segunda geração produzida a partir de bacterias marcadas com 15N e cultivadas em 14N, formavam duas faixas no gradiente de césio, uma correspondente as moléculas não-marcadas (14N) e outra correspondente às moléculas contendo 50% 14N e 50% 15N.

Os Resultados experimentais concordaram, portanto, com a previsão da hipótese da replicação semiconservativa do DNA, a qual foi, então, aceita como verdadeira. Os experimentos realizados por Meselson e Stahl haviam evidenciado que a replicação do DNA era semiconservativa. No entanto, seus resultados não haviam provido nenhuma informação sobre como era a replicação do cromossomo. Questões como “em quantos lugares a replicação é iniciada” (origens da replicação), e “qual seria a direção da replicação”, ainda precisavam ser respondidas.

(2) A replicação tem origem e acontece bilateralmente 

A replicação é um processo altamente coordenado, em que as fitas parentais são desenroladas e replicadas simultaneamente. Quem esclareceu este fato foi John Cairns no início da década de 60. Ele conseguiu observar DNA bacteriano em duplicação. Cairns concluiu que a alça no DNA resulta da formação de duas fitas filhas radioativas, cada uma complementar à uma fita parental. Uma ou ambas as extremidades da alça são pontos dinâmicos, chamados de forquilhas de replicação, onde o DNA parental está sendo desenrolado, e as fitas separadas e sendo rapidamente replicadas.  As alças de replicação se iniciam sempre em um único ponto, chamado de origem. A síntese da nova fita sempre se dá na direção 5 -3, com extremidade 3 livre. Assim a fita que atua como molde está sendo lida da extremidade 3 para a 5

(3 ) A replicação acontece de maneira semi conservativa 

A replicação na forquilha não acontece de maneira igual para as duas novas fitas. Um das novas fitas de DNA é sintetizada em pedaços pequenos, atualmente chamados de fragmentos de Okazaki. Conclui-o que uma fita é sintetizada continuamente e outra descontinuamente. A fita líder ou contínua é aquela em que a síntese prossegue na direção 5-3, na mesma direção do movimento da forquilha de replicação:

A cadeia que cresce no mesmo sentido que o deslocamento da forquilha de replicação, e cuja síntese ocorre continuamente, é chamada de cadeia leading, conforme pode ser visto na figura 1 acima. A cadeia que cresce no sentido oposto ao deslocamento da forquilha de replicação, e cuja síntese ocorre descontinuamente, é chamada de cadeia lagging.

O crescimento da cadeia se dá através do auxilio de enzimas DNA polimerases.  Para que a polimerização do DNA possa ocorrer através das polimerases, alguns pré requisitos devem ser observados: Primeiro, todas as DNA polimerases requerem um molde. A reação de polimerização é guiada por uma fita molde de DNA de acordo com as regras de pareamento de bases preditas por Watson e Crick. A segunda é que os nucleotídeos adicionados na nova fita acontecem a grupo que apresente a hidroxila 3 livre. A extremidade 3 livre é denominada de terminal do iniciador. 

(4 ) As DNA Polimerases 

DNA polimerase é uma classe de enzimas, presente tanto em células procarióticas como em eucarióticas, responsável pela polimerização das novas fitas de DNA. A reação fundamental é a transferência de um grupo fosforila, onde a extremidade 3'-OH é o nucleófilo e o fósforo da extremidade 5' do nucleotídeo que chega sofre ataque nucleofílico com liberação de pirofosfato inorgânico.

Essas enzimas obedecem a algumas propriedades, como:

·        Todas as DNA polimerases requerem um molde.

·        Pareamento complementar das fitas AT e GC.

·        A polimerização deverá acontecer no sentido 5'- 3'

·        O processo de polimerização só irá iniciar-se com a presença de um oligonucleotídeo de RNA denominado RNA primer, pois a DNA polimerase só consegue agir na presença de extremidade 3' livre.

Há três tipos de enzimas catalíticas de DNA polimerase:

·        DNA polimerase I, que tem função corretora (de reparo do DNA), portanto pode ser endonucleásica ou exonucleásica. Ela também faz a retirada dos primers (iniciadores).

·        DNA polimerase II, que é uma polimerase alternativa de reparo, mas que também pode replicar DNA quando o filamento molde é danificado.

·        DNA polimerase III, responsável por não deixar o molde antes de ter sido concluído o processo

DNA Polimerase III 

A replicação requer não apenas uma DNA polimerase, mas 20 ou mais enzimas e proteínas diferentes, cada uma desempenhando uma tarefa especifica, entre elas a helicase (sapara a dupla fita)  que é estabilizada por proteínas de ligação do DNA. Antes que a DNA polimerase possa sintetizar o DNA, os iniciadores precisam estar presentes no molde, geralmente, fragmentos curtos de RNA sintetizados pelas enzimas chamadas de iniciases. No final os iniciadores de RNA devem ser removidos e substituídos pelo DNA. Depois da remoção dos segmentos de RNA e do preenchimento do vazio com DNA, permanece um corte no esqueleto do DNA, na forma de uma ligação fosfodiester quebrada. Esses cortes são selados por enzimas chamadas de DNA ligases. Todos esses processos precisam ser coordenados e regulados, uma ação que tem sido mais bem caracterizada no sistema da E. coli. O complexo inteiro tem sido chamado de sistema da DNA replicase ou replissomo. 

(5 ) Etapas da Replicação do Cromossomo da E.Coli

a) Iniciação

A origem da replicação bacteriana da E. Coli, chamada de oriC, consiste de 245 pares de bases, que possuem elementos na sequência de DNA, altamente conservados nas origens da replicação bacterianas. O arranjo de sequência na origem da replicação oriC da E.coli é dividida em dois sítios: sitio de ligação para a proteína DnaA, com quatro sequencias de 9pb. E sitio com disposição repetitiva de três sequências de 13 pb

Cerca de 20 moléculas de proteínas DnaA, cada uma com um ATP ligado, ligam-se as quatros repetições de 9 bases. O DNA é desenrolado ao redor desse complexo, as três repetições de 13 pares de bases ricas em A – T, são então desnaturadas sequencialmente. Hexameros da proteína DnaB ligam-se a cada fita com a ajuda de proteína DnaC. A atividade helicase desenrola ainda mais o DNA, preparando a iniciação e a síntese do DNA. 

b) Alongamento:

A fase de alongamento da replicação inclui duas operações distintas mas relacionadas: A síntese da fita líder e a síntese da fita atrasada. Várias enzimas na forquilha de replicação são importantes para a síntese de ambas as fitas. O DNA parental é primeiro desenrolado pela DNA helicases, o estresse topológico resultante é aliviado pelas topoisomerases. Cada fita separada é, então, estabilizada pela SSB. A partir desse ponto, o alongamento inicia-se. A síntese da fita líder, a mais direta das duas começa com a síntese de um RNA iniciador curto pela iniciase ( Proteína DnaG), na origem de replicação. Desoxirribonucleotídeos são, então, adicionados a esse iniciador pela DNA polimerase III. A síntese da fita líder prossegue, então, continuamente, mantendo passo com o desenrolamento do DNA na forquilha de replicação. A síntese da fita atrasada é realizada em curtos fragmentos de Okazaki. Assim que um fragmento de Okazaki for completado, seu RNA iniciador é removido e substituído por DNA pela DNA polimerase I o corte remanescente é selado pela DNA ligase.

c) Terminação:

Sequencias ter são posicionadas no cromossomo em dois agregados com orientação opostas. A replicação do DNA que separa as forquilhas de replicação opostas deixa os cromossomos sintetizados unidos como catenanos.

Replicação do cromossomo nos Eucariontes é mais complexa.

As características essenciais da replicação do DNA são as mesmas nos eucariotos e nos procariotos. As origens da replicação são denominadas de sequencias de replicação autônomas ou replicadores. A iniciação da replicação em todos os eucariotos requer uma proteína com muitas subunidades, o complexo de reconhecimento da origem que se liga a várias sequencias dentro do replicador. Como nas bactérias, os eucariotos possuem vários tipos de DNA polimerases. A replicação dos cromossomos nucleares envolve a DNA polimerase alfa, em associação à polimerase gama. 

Texto: Rafael salomão da Silva