Bioquímica- Aula 05 - Os nucleotídeos

Os nucleotídeos

Sumário 

     1- As bases nitrogenadas (característica, as bases, agrupamento, outras bases, AMP, GMP, TMP, CMP, características químicas, ph, solubilidade, conformação, complementariedade através das pontes de H);  

2- As pentoses (duas espécies: 2- desoxi – D- ribose e a D ribose, ou desoxirribonucleotidoe, e a ribonucleotideo, açúcar, diferença da oxidação carbono 2)

3- O Grupo fosfato (liga os nucleotídeos, ligação fosfodiesteres, polaridade 5´-3 linha)

Introdução 

Os nucleotídeos são formados por três componentes característicos: bases nitrogenadas, um grupo pentose e um fosfato. Além do seu papel como subunidades dos ácidos nucléicos, os nucleotídeos possuem uma variedade de outras funções em casa célula: como transportadores de energia, componentes de co-fatores enzimáticos e mensageiros químicos. A molécula sem o grupo fosfato é denominada nucleosídeo.

As bases nitrogenadas 

As bases nitrogenadas são derivadas de dois compostos parentais, pirimidina e purina. Tanto as bases como as pentoses são compostos heterocíclico. As bases unem-se covalentemente por meio de uma ligação N-B- Glicosídica, ao carbono -1’ da pentose. Existem 5 tipos de bases nitrogenadas: Adenina(A), guanina (G), Citosina (C), Timina (T) e Uracila (U). Figura (1); As bases nitrogenadas são agrupadas de acordo com seus compostos parentais como mostra a figura.

As purinas: Adenina e guanina

As pirimidinas: Citosina, Timina e Uracila 

Alguns dos nomes comuns destas bases refletem as circunstâncias de sua descoberta. A guanina, por exemplo, foi isolada primeiramente do guano (esterco de pássaro), e a timina, isolada do tecido do timo. Embora os nucleotídeos contendo as principais purinas e pirimidina sejam mais comuns, tanto o DNA quanto o RNA possuem também algumas bases minoritárias. No DNA a mais comum destas formas são formas metiladas das bases principais. Bases alteradas ou não usuais nas moléculas do DNA frequentemente possuem papéis na regulação ou proteção da informação genética. Bases minoritárias de muitos tipos são também encontradas nos RNAs, especialmente no tRNA.Essas bases são conhecidas como nucleosídeos com e sem fosfatos: Encontradas tanto nas desoxirribonucléicos

As purinas e pirimidinas livres são compostos fracamente básicos. Elas possuem uma variedade de propriedades químicas que afetam a estrutura e a função dos ácidos nucléicos. Umas destas propriedades das bases presentes no DNA e RNA são: a distribuição eletrônica e a capacidade de absorção da luz, propriedades está que possibilitam o estudo destas moléculas na estrutura. Percebeu que as pirimidinas são moléculas planas enquanto as purinas quase planas. As purinas e pirimidinas são hidrofóbicas e relativamente insolúveis em água e pH próximo à neutralidade da célula. Ao modificar o pH do meio, a solubilidade tente aumentar ou diminuir. A partir do estudo de solubilidade percebeu que algumas bases complementavam outras através de interações de pontes de Hidrogênio. 

As pentoses 

Os ácidos nucleicos possuem duas espécies de pentose. As unidades 2 – desoxi- D- ribose  e presentes no DNA ( desoxirribonucleotídicas) e as unidades D-ribose presentes no RNA ( ribonucleotídeos). Ambos os tipos de pentoses são beta furanosídicas. Observe que a diferença está na presença do carbono 2 da furanose. A desoxi irá sofre oxidação, apresentando a perda do oxigênio, ao contrário da Ribose, onde essa oxidação não ocorrerá. 

O grupo Fosfato

O grupo fosfato liga covalentemente os nucleotídeos tanto do DNA como RNA. As ligações fosfodiésteres possuem a mesma orientação ao longo da cadeia, conferindo a cada fita linear do ácido nucleico uma polaridade especifica e distinta nas extremidades 5’ e 3’. Por conversão, a estrutura        de uma fita simples de ácido nucleico é sempre escrita com a extremidade 5’ na esquerda a extremidade 3’ na direita. 

Bioquímica - Aula 04 - Transcrição

Transcrição (Síntese de RNAs) 

Transcrição nas E.Coli ( Bactérias) 

A transcrição assemelha-se à replicação: ambos apresentam a mesma direção de síntese, fases de iniciação, alongamento e terminação. A transcrição difere da replicação pelo fato de não requerer um iniciador, e apenas um dos lados é usado como molde.

Os trabalhos e definições das propriedades fundamentais da transcrição tiveram início com o isolamento e estudo da RNA polimerase. A RNA polimerase depende do DNA como molde, além de todas as quatros ribunucleosídeos- 5- trifosfato ( ATP, GTP, UTP, CTP) como precursores das unidades nucleotídicas do RNA, bem como o íon magnésio. A síntese do RNA tem muito em comum com a síntese do DNA: A RNA polimerase alonga uma fita de RNA adicionando unidades ribunucleosídeos na extremidade hidroxila 3’ construindo a fita de RNA na direção 5’-3’. 

A iniciação da síntese do RNA requer várias etapas, geralmente divididas em duas fases: as fases de ligação e de iniciação. Contudo ela tem inicio quando a RNA polimerase se liga a uma sequência especifica do DNA, chamadas promotores. A sequência do promotor não é idêntica para todas as bacterianas dessa classe, dessa forma, as sequências variam de promotor para promotor, todavia, as sequências em comum são denominadas: sequências consenso.

Durante a fase de alongamento da transcrição, a extremidade crescente da nova fita de RNA faz pareamento de bases temporariamente com o DNA molde para formar um híbrido RNA-DNA de dupla hélice, desfaz logo em seguida. Ainda nesta fase à formação das bolhas de transcrição.

Figura . Transcrição pela RNA polimerase na E.coli. Para sintetizar uma fita de RNA complementar a uma das duas fitas de DNA em duplas hélice, o DNA é transitoriamente desenrolado, em um determinado momento, uma bolha de transcrição é gerada, movendo-se da esquerda para a direita. O DNA é desenrolado na frente e reenrolado atrás, à medida que o RNA transcrito.

As duas fitas complementares do DNA possuem papéis diferentes na transcrição. A fita que funciona como molde para a síntese do RNA é chamada de fita molde. A fita não de DNA complementar ao molde, fita-não molde ou codificada que é idêntica na sua sequencia de bases ao RNA transcrito do gene, com U no lugar de T. O RNA polimerases não possuem uma atividade exonuclease 3’-5’ revisora, todavia, um erro em uma molécula de RNA é de menor conseqüência para a célula do que no DNA.

Transcrição nos Eucariotos.

A maquinaria transcricional no núcleo de uma célula eucariótica é muito mais complexa do que na bactéria. Os eucariotos possuem três RNA polimerases, designados I, II, III, que são complexos distintos, mas possuem certas subunidades em comum.

(1) As RNA polimerases

O RNA Polimerase I (Pol I) é responsável pela síntese de apenas um tipo de RNA, um transcrito de RNA pré-ribossomal, a principal função da RNA polimerase II (Pol II) é a sínstese dos mRNAs e alguns RNAs especializados. O RNA polimerase III ( Pol III) sintetiza tRNAs, o rRNA 5S e alguns outros RNAs pequenos especializados.  

( Pol II)

A pol II é central para a expressão dos genes eucarióticos e tem sido estudada extensivamente. Ela requer um dispositivo de outras proteínas, chamadas de fatores de transcrição, ordenadas para formar o complexo de transcrição ativo. O processo de transcrição pela pol II pode ser descrito em termos de várias fases- montagem, iniciação, alongamento e terminação. Uma vez completado o transcrito de RNA, a transcrição é terminada por mecanismos ainda não reconhecidos. A pol II é desfosforilada e reciclada, pronta para iniciar um outro transcrito. 

Figura . RNA polimerase II 

(2) A formação e processamento do RNA

A formação do RNAm primário ( Pré-síntese) 

Uma molécula de RNA recém-sintetizada é chamada de transcrito primário. O transcrito primário de um mRNA eucariótico usualmente contém sequencias cercando um gene, embora as sequencias codificadoras do polipeptídio possa não ser contínuas. Regiões não-codificadoras que quebram a região codificadora do transcrito são chamadas de íntrons, e os segmentos codificadores são chamados de éxons. Em um processo chamado de emenda, os íntrons são removidos dos transcritos primários e os éxons unidos para formar uma sequencia continua, especificando um polipeptídio funcional.

Figura . Pré-síntese do RNA m

Os mRNAs eucarióticos são também modificados em cada extremidade. Uma estrutura chamada de capacete é adicionada à extremidade 5’. A extremidade 3’ é clivada, a alguns resíduos de adenilato são adicionados para criar uma cauda poli(A)

Complemento: Há quatro classes de íntrons. As duas primeiras, chamadas de íntrons dos grupos I e II, diferentes em alguns detalhes de seu mecanismo de emenda.  Ambos são autocortáveis, nenhuma enzima está envolvida neste processo. As funções do capacete 5’ e da cauda poli(A) 3’ são apenas parcialmente conhecidas. O capacete 5’ liga-se a uma proteína específica e pode participar da ligação do mRNA ao ribossomo para iniciar a tradução. A cauda poli(A) também funciona como um sítio de ligação para uma proteína específica. É provável que o capacete 5’, a cauda poli(A) e suas proteínas associadas ajudem a proteger o mRNA da destruição enzimática. A transcrição dos íntrons consome recursos celulares e energia, sem retornar nenhum beneficio óbvio ao organismo; entretanto, os íntrons podem conferir uma vantagem ainda não considerada pelos cientistas. 

A formação do RNAr e RNAt primário ( Pré-síntese) 

O processamento não apenas limitado ao RNA mensageiro, os RNAs ribossômicos, tanto bacterianos, quantos eucarióticos, são sintetizados a partir de precursores denominados: pré-ribossômicos.

 Na E.Coli, por exemplo, os RNAs ribossomais 16S, 23S e 5S e alguns transportadores são originados de um único precursor por múltiplas cópias de gene RNA 30S. Nos eucariotos, um transcrito do RNA pré-ribossômico 45S é processado no nucléolo para formar os RNAs ribossomais 18S, 28S e 5,8S, característicos dos ribossomos eucarióticos.O processo de formação então, se dá através da clivagem por ribonucleoproteínas dos RNAs pré-ribossômicos resultando nos rRNAs tRNAs maduros que vão constituir o ribossomo e transportadores. A maioria das células possui 40 a 50 tRNAs distintos, e as células eucarióticas possuem múltiplas cópias de muitos dos genes de RNA transportador.

Os transportadores são derivados de precursores de RNA maiores, pela remoção enzimática das unidades nucleotídicas a partir das extremidades 5’ e 3’ da molécula madura e retirada do único íntron. O mecanismo de retirada íntron de RNAt ocorre em duas etapas: na primeira, ocorre a clivagem endonucleasica nas extremidades 5’-3’. Na segunda etapa ocorre a ligação dos dois exons para a formação do tRNA maduro. A ligação dos dois exons é feita por um RNA-ligase. 

Complemento

Os precursores de RNA transportador podem sofrer um outro processamento pós-transcricional. Este processo é a adição do trinucleotídeo 3’ terminal CCA(3’), ao qual um aminoácido será ligado durante a síntese de proteínas. Essa adição é realizada pela enzima tRNA nucleotidiltransferase. Essa definição de nucleotídeos é independente de um molde de DNA ou RNA.

O tipo final de processamento do tRNA é a modificação de algumas das bases por metilação, deaminação ou redução. Todo o processamento são regulados pela concentração de síntese e degradação dos RNAs. Quando a síntese e a degradação estiverem balanceados, sua concentração permanecerá em equilíbrio estacionário. 

Bioquímica - Aula 02- Replicação

   

           Replicação, transcrição e tradução 

           Replicação, transcrição e tradução 

Replicação

(1) Evidência da replicação semi conservativa

Cada fita do DNA funciona como um molde para a síntese de uma nova fita, produzindo duas novas moléculas de DNA, cada uma com uma fita nova (1’ e 2’)  e uma fita velha (1 e 2) . Isso é denominado de replicação semi conservativa.

A replicação semiconservativa foi proposta por Watson e Crick e demonstrada pelo experimento de Matthew Meselson e Franklin Stahl. Meselson e Stahl imaginaram que, se as duas cadeias polinucleotídicas de uma molécula de DNA fossem marcadas, seria possível fazer uma previsão sobre o destino dessas cadeias no decorrer das gerações celulares subsequentes.

Para isso, marcaram as moléculas parentais de DNA com um isótopo pesado, mas não radioativo, o nitrogênio 15N. Fizeram isso cultivando Escherichia coli no meio de cultura como única fonte de nitrogênio disponível um sal contendo isótopo 15N. Após 14 gerações nesse meio de cultura, pôde-se prever que todo o DNA das bactérias continha 15N ao invés de 14N. As bactérias foram, então, transferidas para um meio de cultura contendo apenas a forma leve do nitrogênio, o 14N. Assim, todo o DNA sintetizado a partir desse momento, seria sintetizado com o 14N, e não mais com 15N. De acordo com a hipótese da replicação semiconservativa era previsto que, após um ciclo de replicação no novo meio de cultura (contendo apenas 14N), cada nova molécula de DNA conteria 50% de 15N e 50% de 14N; e, após dois ciclos de replicação, metade das moléculas de DNA conteria apenas 14N enquanto que a outra metade seria 50% 15N e 50% 14N, conforme podemos ver no esquema mostrado a explicação a seguir

Experimento: 

A.1 - Cultivou E.coli em um meio de cultura contendo N15

A.2 - Após várias gerações terem se desenvolvidas no meio com azoto pesado, foram transferidas para um meio com azoto normal N14. Imediatamente após a transferência, foi retirada uma amostra de onde se extraiu o DNA que foi sujeito a centrifugação

A.3 – Ao fim de 20 minutos ( tempo necessário para que estas bactérias se dividissem e dessem origem a uma nova geração), foi retirada uma amostra, extraído o DNA e centrifugado.

A.4 - Ao fim de 40 minutos, foi retirada uma nova amostra que foi sujeita ao procedimento anterior ( extração e centrifugação de DNA). 

           Replicação, transcrição e tradução 

A distinção entre os diferentes tipos de DNA foi possível graças à técnica analítica desenvolvida por Jerome Vinograd, que ficou conhecida como centrifugação de equilíbrio em gradiente de densidade. O gradiente de densidade se forma quando uma solução de cloreto de césio é submetida a uma ultracentrifugação. O sal de césio fica distribuído em concentrações gradativamente maiores, do topo para o fundo do tubo de ensaio, de modo que a solução é mais densa no fundo e menos densa no topo. Quando moléculas são misturadas a uma solução de cloreto de césio, e essa mistura é submetida a uma ultracentrifugação, as moléculas se posicionarão no gradiente de densidade do césio, em uma faixa correspondente à sua própria densidade.

Moléculas de DNA com diferentes proporções de 14N e 15N tem densidades diferentes e, portanto, se posicionarão em regiões diferentes no tubo de ensaio de acordo com a proporção que possuírem desse elemento. O 15N é mais denso que o 14N, portanto teremos as moléculas de DNA distribuídas da seguinte maneira no tubo:

Em seu experimento, Meselson e Stahl verificaram, que:

1 – moléculas de DNA extraídas de bactérias cultivadas em meio normal com 14N formavam uma faixa na parte superior do gradiente de cloreto de césio, ou seja, tinham uma densidade relativamente baixa.
2 – O DNA extraído de bactérias cultivadas por 14 gerações em 15N, formava uma faixa na parte inferior do gradiente, isto é, tinha uma densidade relativamente alta.
3 – O DNA extraído da primeira geração produzida a partir de bacterias marcadas com 15N e cultivadas em 14N, ficavam numa posição intermediária do gradiente, entre as duas anterioes.
4 – O DNA extraído da segunda geração produzida a partir de bacterias marcadas com 15N e cultivadas em 14N, formavam duas faixas no gradiente de césio, uma correspondente as moléculas não-marcadas (14N) e outra correspondente às moléculas contendo 50% 14N e 50% 15N.

Os Resultados experimentais concordaram, portanto, com a previsão da hipótese da replicação semiconservativa do DNA, a qual foi, então, aceita como verdadeira. Os experimentos realizados por Meselson e Stahl haviam evidenciado que a replicação do DNA era semiconservativa. No entanto, seus resultados não haviam provido nenhuma informação sobre como era a replicação do cromossomo. Questões como “em quantos lugares a replicação é iniciada” (origens da replicação), e “qual seria a direção da replicação”, ainda precisavam ser respondidas.

(2) A replicação tem origem e acontece bilateralmente 

A replicação é um processo altamente coordenado, em que as fitas parentais são desenroladas e replicadas simultaneamente. Quem esclareceu este fato foi John Cairns no início da década de 60. Ele conseguiu observar DNA bacteriano em duplicação. Cairns concluiu que a alça no DNA resulta da formação de duas fitas filhas radioativas, cada uma complementar à uma fita parental. Uma ou ambas as extremidades da alça são pontos dinâmicos, chamados de forquilhas de replicação, onde o DNA parental está sendo desenrolado, e as fitas separadas e sendo rapidamente replicadas.  As alças de replicação se iniciam sempre em um único ponto, chamado de origem. A síntese da nova fita sempre se dá na direção 5 -3, com extremidade 3 livre. Assim a fita que atua como molde está sendo lida da extremidade 3 para a 5

(3 ) A replicação acontece de maneira semi conservativa 

A replicação na forquilha não acontece de maneira igual para as duas novas fitas. Um das novas fitas de DNA é sintetizada em pedaços pequenos, atualmente chamados de fragmentos de Okazaki. Conclui-o que uma fita é sintetizada continuamente e outra descontinuamente. A fita líder ou contínua é aquela em que a síntese prossegue na direção 5-3, na mesma direção do movimento da forquilha de replicação:

A cadeia que cresce no mesmo sentido que o deslocamento da forquilha de replicação, e cuja síntese ocorre continuamente, é chamada de cadeia leading, conforme pode ser visto na figura 1 acima. A cadeia que cresce no sentido oposto ao deslocamento da forquilha de replicação, e cuja síntese ocorre descontinuamente, é chamada de cadeia lagging.

O crescimento da cadeia se dá através do auxilio de enzimas DNA polimerases.  Para que a polimerização do DNA possa ocorrer através das polimerases, alguns pré requisitos devem ser observados: Primeiro, todas as DNA polimerases requerem um molde. A reação de polimerização é guiada por uma fita molde de DNA de acordo com as regras de pareamento de bases preditas por Watson e Crick. A segunda é que os nucleotídeos adicionados na nova fita acontecem a grupo que apresente a hidroxila 3 livre. A extremidade 3 livre é denominada de terminal do iniciador. 

(4 ) As DNA Polimerases 

DNA polimerase é uma classe de enzimas, presente tanto em células procarióticas como em eucarióticas, responsável pela polimerização das novas fitas de DNA. A reação fundamental é a transferência de um grupo fosforila, onde a extremidade 3'-OH é o nucleófilo e o fósforo da extremidade 5' do nucleotídeo que chega sofre ataque nucleofílico com liberação de pirofosfato inorgânico.

Essas enzimas obedecem a algumas propriedades, como:

·        Todas as DNA polimerases requerem um molde.

·        Pareamento complementar das fitas AT e GC.

·        A polimerização deverá acontecer no sentido 5'- 3'

·        O processo de polimerização só irá iniciar-se com a presença de um oligonucleotídeo de RNA denominado RNA primer, pois a DNA polimerase só consegue agir na presença de extremidade 3' livre.

Há três tipos de enzimas catalíticas de DNA polimerase:

·        DNA polimerase I, que tem função corretora (de reparo do DNA), portanto pode ser endonucleásica ou exonucleásica. Ela também faz a retirada dos primers (iniciadores).

·        DNA polimerase II, que é uma polimerase alternativa de reparo, mas que também pode replicar DNA quando o filamento molde é danificado.

·        DNA polimerase III, responsável por não deixar o molde antes de ter sido concluído o processo

DNA Polimerase III 

A replicação requer não apenas uma DNA polimerase, mas 20 ou mais enzimas e proteínas diferentes, cada uma desempenhando uma tarefa especifica, entre elas a helicase (sapara a dupla fita)  que é estabilizada por proteínas de ligação do DNA. Antes que a DNA polimerase possa sintetizar o DNA, os iniciadores precisam estar presentes no molde, geralmente, fragmentos curtos de RNA sintetizados pelas enzimas chamadas de iniciases. No final os iniciadores de RNA devem ser removidos e substituídos pelo DNA. Depois da remoção dos segmentos de RNA e do preenchimento do vazio com DNA, permanece um corte no esqueleto do DNA, na forma de uma ligação fosfodiester quebrada. Esses cortes são selados por enzimas chamadas de DNA ligases. Todos esses processos precisam ser coordenados e regulados, uma ação que tem sido mais bem caracterizada no sistema da E. coli. O complexo inteiro tem sido chamado de sistema da DNA replicase ou replissomo. 

(5 ) Etapas da Replicação do Cromossomo da E.Coli

a) Iniciação

A origem da replicação bacteriana da E. Coli, chamada de oriC, consiste de 245 pares de bases, que possuem elementos na sequência de DNA, altamente conservados nas origens da replicação bacterianas. O arranjo de sequência na origem da replicação oriC da E.coli é dividida em dois sítios: sitio de ligação para a proteína DnaA, com quatro sequencias de 9pb. E sitio com disposição repetitiva de três sequências de 13 pb

Cerca de 20 moléculas de proteínas DnaA, cada uma com um ATP ligado, ligam-se as quatros repetições de 9 bases. O DNA é desenrolado ao redor desse complexo, as três repetições de 13 pares de bases ricas em A – T, são então desnaturadas sequencialmente. Hexameros da proteína DnaB ligam-se a cada fita com a ajuda de proteína DnaC. A atividade helicase desenrola ainda mais o DNA, preparando a iniciação e a síntese do DNA. 

b) Alongamento:

A fase de alongamento da replicação inclui duas operações distintas mas relacionadas: A síntese da fita líder e a síntese da fita atrasada. Várias enzimas na forquilha de replicação são importantes para a síntese de ambas as fitas. O DNA parental é primeiro desenrolado pela DNA helicases, o estresse topológico resultante é aliviado pelas topoisomerases. Cada fita separada é, então, estabilizada pela SSB. A partir desse ponto, o alongamento inicia-se. A síntese da fita líder, a mais direta das duas começa com a síntese de um RNA iniciador curto pela iniciase ( Proteína DnaG), na origem de replicação. Desoxirribonucleotídeos são, então, adicionados a esse iniciador pela DNA polimerase III. A síntese da fita líder prossegue, então, continuamente, mantendo passo com o desenrolamento do DNA na forquilha de replicação. A síntese da fita atrasada é realizada em curtos fragmentos de Okazaki. Assim que um fragmento de Okazaki for completado, seu RNA iniciador é removido e substituído por DNA pela DNA polimerase I o corte remanescente é selado pela DNA ligase.

c) Terminação:

Sequencias ter são posicionadas no cromossomo em dois agregados com orientação opostas. A replicação do DNA que separa as forquilhas de replicação opostas deixa os cromossomos sintetizados unidos como catenanos.

Replicação do cromossomo nos Eucariontes é mais complexa.

As características essenciais da replicação do DNA são as mesmas nos eucariotos e nos procariotos. As origens da replicação são denominadas de sequencias de replicação autônomas ou replicadores. A iniciação da replicação em todos os eucariotos requer uma proteína com muitas subunidades, o complexo de reconhecimento da origem que se liga a várias sequencias dentro do replicador. Como nas bactérias, os eucariotos possuem vários tipos de DNA polimerases. A replicação dos cromossomos nucleares envolve a DNA polimerase alfa, em associação à polimerase gama. 

Texto: Rafael salomão da Silva