1- Fundamentos básicos da cromatografia
2- Tipos de processos físicos
3- Definição de cromatografia líquida
4- Cromatografia clássica x moderna
5- Mecanismos usados na separação em cromatografia liquida de alta eficiência: Adsorção, partição, fase ligada, quiral, por troca iônica, exclusão e filtração em Gel.
6- A fase móvel: conceito, características físico-química, força cromatográfica, seletividade, preparação e uso de solução tampão
7- Eluição: Isocrática e por gradiente.
8- A coluna cromatográfica: Tipos, técnicas de enchimento, condicionamento e efeitos da temperatura sobre a coluna.
9- Coluna de separação: função, característica do mecanismo de separação da fase estacionária
10- Parte do equipamento: Reservatório, bomba de alta pressão, programadores, coluna e detectores.
11 - Desenvolvimento da Separação.
1- FUNDAMENTOS BÁSICOS DA CROMATOGRAFIA
A cor azul representa o tipo de técnica, a vermelha, tipo de fase móvel e verde fase estacionário. Elas são divididas de acordo com seus estado físico da matéria.
Cromatografia pode ser dita como um processo de separação de mistura pela interação diferenciada dos seus componentes entre uma FASE MÓVEL ( Líquida ou Gasosa) e ESTACIONÁRIA ( Sólida ou Líquida)
Eluição: Amostra + fase móvel percorrida pelo sistema
Método de separação: Pode ser físico, químico e mecânico
Fase estacionária: Apresentar nos estados sólidos, fase ligada e líquido.
Fase estacionária é sólida: O processo se dá por adsorção do soluto presente na fase móvel. Neste processo ocorre uma interação entre a FE e FM, devido a presença de grupos ativos na superfície da FE. O retorno à FM dos analitos ocorre por diferença de volatilidade ou solubilidade entre a FE.
Fase estacionária é Liquida: Espalha-se em um suporte sólido, inerte, ou na parede do tudo; a separação pode ser por adsorção ou partição baseada na diferença de solubilidade dos componentes da amostra na fase estacionária.
Fase estacionária é uma fase ligada: São obtidas por reações entre os grupos ativos presente na sílica (OH) que se encontra na superfície de um suporte e um agente representado por grupos funcionais, centro quirais ,grupos funcionais ionizáveis ou compostos de bioafinidade.
O mecanismo de ação neste tipo de fase é feito tanto por adsorção quanto partição.
Fase estacionária é um sólido inerte: como partículas de forma, tamanho e porosidade uniforme.O mecanismo de ação no processo de separação é mecânico. As moléculas da amostras são separadas por diferença de tamanho. Moléculas menores são capazes de passarem facilmente pelos poros e entre os grânulos, as maiores ficam retidas no material.
Termos:
Na plana usa-se distância (Dm) - Distância percorrida
Na pressurizada usa-se tempo (Tr) - Tempo de retenção
- Tr = tempo de retenção é tempo gasto deste o ato de injeção até a saída do ponto máximo do pico do sistema.
- T'r = tempo de retenção relativo é o tempo que o soluto fica retido na fase estacionária.
- Vr = Volume de retenção é o volume da fase móvel necessária para eluir m componente
- Vm = Volume morto é o volume da fase móvel nos poros da fase estacionária e interstícios entre as partículas da coluna recheada ou espaço vazio apenas com a FE.
K = fator de retenção que é determinado pela razão das quantidades das suas moléculas que ficam retidas na fase estacionárias, ns, ou percorrendo a a coluna na fase móvel, nM. Tempo está relacionado ao tempo quem que a FM fica na coluna.
α = Fator de separação que é calculara pela razão entre o fator de retenção.
rist = Retenção relativa é a razão de tempo de retenção ajustada.
Rs = Resolução é calculada a partir da distância que separa os pontos máximos dos picos e da média das larguras de suas respectivas bases, Wb, ou largura na meia altura.
2- DEFINIÇÃO DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA.
Um processo de separação de misturas que utiliza instrumentos automatizados que empregam colunas recheadas com material especialmente preparados e uma fase móvel eluída sob alta pressão. As separações tanto podem ser na ordem quantitativa como qualitativa.
3- CROMATOGRAFIA LÍQUIDA CLÁSSICA X CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
Clássica
Utiliza coluna de vidro com diâmetro interno igual ou superior a 10 cm, partículas relativamente grandes de 60 a 200µm s. O eluente é movido com auxílio da força gravitacional, a coluna neste tipo de processo é utilizada apenas uma vez, pois absorve a fase estacionária de forma irreversível, a fração do eluente é coletada de forma individual. O tempo gasto neste processo e extremamente longo, a análise das frações são feitas de maneira manual, porem esse processo de separação é de baixo custo.
Alta eficiência
Colunas fechadas, processo com alto custo financeiro, contudo neste processo, a coluna pode ser reutilizada, as colunas são mais eficientes, com recheios dos mais variados tipos, poder de analise com alta resolução, neste processo utiliza-se de bomba de alta pressão, a vazão da FM é controlada, o registro é feito por detectores presentes na saída da coluna, analise quantitativo em um nível de alta precisão e exatidão. Requer que a amostra seja solúvel na fase móvel.
Vantagens e Desvantagens do uso da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ( CLAE).
Vantagens: tempo reduzido de análise, alta resolução, boa análise qualitativa, boa detectabilidade, versatilidade e mecanização
Desvantagens: Alto custo de instrumentação e operação, falta de um detector universal, necessidade de experiência no seu manuseio.
4- MECANISMOS DE SEPARAÇÃO ENTRE A FM e FE
Adsorção ou líquido-sólido
A adsorção é um processo espontâneo e reversível que ocorre quando a superfície de um sólido é exposta a um fluido, gás ou líquido, compreendendo a impregnação desse fluido na interface do sólido em contato com o fluido
baseia na competição entre moléculas da amostra e da fase móvel, para ocupar os sítios ativos na superfície de um sólido ( fase estacionária). Para que a molécula do soluto possa ser adsorvida na fase estacionária, a molécula da FM deve descolar na superfície da Estacionária. Se a FE possuir uma superfície polar, grupos polares terão pouca afinidade, não sendo retidos, em contra-partida, grupos polares terão uma maior afinidade e serão fortemente retidos. É importante que a FE tenha uma grande superfície de contato, pois apresentará uma grande número de sítios ativos para interação com a amostra da FM. No processo de adsorção a fase móvel tem que ter polaridade inversa a fase estacionária. Neste caso, apolar.
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