Química- Aula 01- CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA - PARTE I

SUMÁRIO 

1- Fundamentos básicos da cromatografia

2- Tipos de processos físicos 

3- Definição de cromatografia líquida 

4- Cromatografia clássica x moderna

5- Mecanismos usados na separação  em cromatografia liquida de alta eficiência: Adsorção, partição, fase ligada, quiral, por troca iônica, exclusão e filtração em Gel. 

6- A fase móvel: conceito, características físico-química, força cromatográfica, seletividade, preparação e uso de solução tampão

7- Eluição: Isocrática e por gradiente.

8- A coluna cromatográfica: Tipos, técnicas de enchimento, condicionamento e efeitos da temperatura sobre a coluna. 

9- Coluna de separação: função, característica do mecanismo de separação da fase estacionária

10- Parte do equipamento: Reservatório, bomba de alta pressão, programadores, coluna e detectores. 

11 - Desenvolvimento da Separação. 

1- FUNDAMENTOS BÁSICOS DA CROMATOGRAFIA 

A cor azul representa o tipo de técnica, a vermelha, tipo de fase móvel e verde fase estacionário. Elas são divididas de acordo com seus estado físico da matéria. 

Cromatografia pode ser dita como um processo de separação de mistura pela interação diferenciada dos seus componentes entre uma FASE MÓVEL ( Líquida ou Gasosa) e ESTACIONÁRIA ( Sólida ou Líquida) 

Eluição: Amostra + fase móvel percorrida pelo sistema

Método de separação: Pode ser físico, químico e mecânico

Fase estacionária: Apresentar nos estados sólidos, fase ligada e líquido. 

Fase estacionária é sólida: O processo se dá por adsorção do soluto presente na fase móvel. Neste processo ocorre uma interação entre a FE e FM, devido a presença de grupos ativos na superfície da FE. O retorno à FM dos analitos ocorre por diferença de volatilidade ou solubilidade entre a FE. 

Fase estacionária é Liquida: Espalha-se em um suporte sólido, inerte, ou na parede do tudo; a separação pode ser por adsorção ou partição baseada na diferença de solubilidade dos componentes da amostra na fase estacionária. 

Fase estacionária é uma fase ligada: São obtidas por reações entre os grupos ativos presente na sílica (OH) que se encontra na superfície de um suporte e um agente representado por grupos funcionais, centro quirais ,grupos funcionais ionizáveis ou compostos de bioafinidade.

O mecanismo de ação neste tipo de fase é feito tanto por adsorção quanto partição.

Fase estacionária é um sólido inerte: como partículas de forma, tamanho e porosidade uniforme.O mecanismo de ação no processo de separação é mecânico. As moléculas da amostras são separadas por diferença de tamanho. Moléculas menores são capazes de passarem facilmente pelos poros e entre os grânulos, as maiores ficam retidas no material. 

Termos:

 Na plana usa-se distância (Dm) - Distância percorrida

 Na pressurizada usa-se tempo (Tr) - Tempo de retenção

- Tr = tempo de retenção é  tempo gasto deste o ato de injeção até a saída do ponto máximo do pico do sistema. 

- T'r = tempo de retenção relativo é o tempo que o soluto fica retido na fase estacionária. 

- Vr = Volume de retenção é o volume da fase móvel necessária para eluir m componente 

- Vm = Volume morto é o volume da fase móvel nos poros da fase estacionária e interstícios entre as partículas da coluna recheada ou espaço vazio apenas com a FE. 

K = fator de retenção que é determinado pela razão das quantidades das suas moléculas que ficam retidas na fase estacionárias, ns, ou percorrendo a a coluna na fase móvel, nM. Tempo está relacionado ao tempo quem que a FM fica na coluna. 

α  = Fator de separação que é calculara pela razão entre o fator de retenção. 

rist = Retenção relativa é a razão de tempo de retenção ajustada.

Rs = Resolução é calculada a partir da distância que separa os pontos máximos dos picos e da média das larguras de suas respectivas bases, Wb, ou largura na meia altura. 

2- DEFINIÇÃO DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA. 

Um processo de separação de misturas que utiliza instrumentos automatizados que empregam colunas recheadas com material especialmente preparados e uma fase móvel eluída sob alta pressão. As separações tanto podem ser na ordem quantitativa como qualitativa. 

3- CROMATOGRAFIA LÍQUIDA CLÁSSICA X CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

Clássica

Utiliza  coluna de vidro com diâmetro interno igual ou superior a 10 cm, partículas relativamente grandes de 60 a 200µm s. O eluente é movido com auxílio da força gravitacional, a coluna neste tipo de processo é utilizada apenas uma vez, pois absorve a fase estacionária de forma irreversível, a fração do eluente é coletada de forma individual. O tempo gasto neste processo e extremamente longo, a análise das frações são feitas de maneira manual, porem esse processo de separação é de baixo custo. 

Alta eficiência

Colunas fechadas, processo com alto custo financeiro, contudo neste processo, a coluna pode ser reutilizada, as colunas são mais eficientes, com recheios dos mais variados tipos, poder de analise com alta resolução, neste processo utiliza-se de bomba de alta pressão, a vazão da FM é controlada, o registro é feito por detectores presentes na saída da coluna, analise quantitativo em um nível de alta precisão e exatidão. Requer que a amostra seja solúvel na fase móvel. 

Vantagens e Desvantagens do uso da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ( CLAE). 

Vantagens: tempo reduzido de análise, alta resolução, boa análise qualitativa, boa detectabilidade, versatilidade e mecanização

Desvantagens: Alto custo de instrumentação e operação, falta de um detector universal, necessidade de experiência no seu manuseio.

4- MECANISMOS DE SEPARAÇÃO ENTRE A FM e FE

Adsorção ou líquido-sólido

A adsorção é um processo espontâneo e reversível que ocorre quando a superfície de um sólido é exposta a um fluido, gás ou líquido, compreendendo a impregnação desse fluido na interface do sólido em contato com o fluido

baseia na competição entre moléculas da amostra e da fase móvel, para ocupar os sítios ativos na superfície de um sólido ( fase estacionária). Para que a molécula do soluto possa ser adsorvida na fase estacionária, a molécula da FM deve descolar na superfície da Estacionária. Se a FE possuir uma superfície polar, grupos polares terão pouca afinidade, não sendo retidos, em contra-partida, grupos polares terão uma maior afinidade e serão fortemente retidos. É importante que a FE tenha uma grande superfície de contato, pois apresentará uma grande número de sítios ativos para interação com a amostra da FM. No processo de adsorção a fase móvel tem que ter polaridade inversa a fase estacionária. Neste caso, apolar. 

Curiosidade II - A ciências explica o Amor

(...) Costumo contar essa história praticamente em todo início de Aula para minhas primeiras turmas; (1) porque o amor é uma sintonia entre a química, biologia, e biopsicossocial, (2) Todo seu entendimento está atrelado a um fator essencial para nós,  vida! (...)

É fácil notar quando a pessoa está apaixonada, aquela cara de abestalhado, as atitudes muitas das vezes irracionais, ditadas em frases: " O Amor é cego".. Pois bem, mais afinal, o que é o Amor? Para responder a esta pergunta, contarei uma história, ela começa mais ou menos assim. 

O autor, 

CAPÍTULO 1 - A BELEZA, O AMOR E A SIMETRIA PERFEITA

Maria está andando na Av. Barão, distraída, como toda mulher, sua mente não parece tirar folga, ao passo que anda, seus mil pensamentos não deixam-se concentrar. O seu belo rosto reluz ao sol, em pleno verão de uma Segunda-Feira,  11:15 da manhã, as nuvens parecem ter divorciadas para dá espaço ao céu azul, ao mesmo tempo que pensa, seu corpo inteiro reclama do calor. Maria é uma mulher de seus 20 e poucos anos, estatura média, determinada, terminando a faculdade de direito, feliz da vida por viver uma vida leve, e suave. No amor, Maria sofreu um bocado, entre seus dois relacionamentos, diga-se de passagem, traumático, ela decidiu dá um tempo ao tempo, viver como as nuvens no céu, separa-das do amor, no qual seu novo espaço esta aberto para clarear novos dias. Em um dos seus relacionamento, conta ela à mim mais tarde, quando vi a conhecer, neste mesmo dia, no banco,  foi com João. Bem, ela  conheceu o joão na fila do supermercado, em uma tarde de sábado;

- Quando o vi, conta ela a mim, fixei meus olhos em seu rosto, parecia algo possuidor, penetrante, não parei mais de olhar para ele, a sua beleza me paralisou.

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Pausa para meus pensamentos (Mais afinal, o que é a beleza?)

Observe as duas imagens:

Podemos notar que a Figura A é mais harmônica que a Figura B, logo a primeira é mais simétrica que a segunda. Se fossemos fazer uma pesquisa e pergunta-se qual dos rostos é aparentemente mais bonito, possivelmente a resposta seria a figura A.

O que liga a simetria facial a beleza é o fato de como nossa mente interpreta a imagem na qual vemos a cima, quando seus olhos enxergam a figura 1, sua mente trabalha de forma mais intensa, passando mais tempo analisando o rosto de interesse, alguns hormônios atuam neste momento, aumentando a sensação de prazer e bem estar  - (por isso quando estamos na paquera, passamos a olhar a pessoa com mais atenção, pois cada vez que você olha, seu cérebro é recompensado com sensações boas) - .

Em contrapartida, quando observa-se a figura 2,

Sua mente exigirá mais para entender como esse rosto é formado, o gasto de energia é maior, pois o encaixe simétrico é levemente desproporcional, seu rosto é mais redondo, a distância entre os olhos maior, a luz que reflete neste rosto é processada no nosso cérebro que analisará de n formas, até chagar a conclusão que essa simetria, se comparada a primeira é mais desarmônica, ou seja, mais feia

Assim, a informação visual sobre o outro- especialmente no que se refere o rosto - ocupa um papel importante na escolha do parceiro. Sua função desperta o chamado: " sistema de recompensa cerebral"

No lance da paquera, existem outros fatores que motivam nossa mente, a mulher é extremamente detalhista e observadora, quando maria olhou para joão, em segundos ela já tinha reparado a cor do cabelo, tipo, sorriso, altura, forma,olhar, cor, traços, e outras atribuições, na biologia denominamos isso de seleção sexual, na vida- de olhar 47. rsrsr

Muito dos homens reclamam com o fato da mulher ser interesseira, e rótulos deste tipo, alerto a você, caro leitor que isso faz parte do trama da vida. Você não queria nascer de um filho de mendigo, concorda? ou de um Pai hippe vida louca? A mulher não irá passar na rua, olhar para o Mendigo e dizer: MENNNNNNNNNDIGO SEU LINDO, te quero, vamos nos casar e ter 10 filhos.

    A seleção sexual condiz a mulher uma escolha que lhe traga segurança em um retorno, uma vez que- um possível relacionamento - uma possível geração de prole pode ocorrer, um homem bem estabilizado, com uma segurança financeira, biologicamente, irá garantir uma somatória do casal para maiores chances de sobrevivência do filho gerado.

Próxima semana tem mais...

Curiosidade I

Cientistas criam bactéria que "come" o CO2 do ar

Ironicamente, a solução para o aquecimento global pode estar numa criatura que adora calor: a bactéria Pyrococcus furiosus, que vive dentro de vulcões submarinos onde a temperatura chega a 100 graus. Numa experiência feita pela Universidade da Geórgia, nos EUA, esse micróbio recebeu cinco genes de outra bactéria subaquática, a Metallosphaera sedula. E dessa mistura saiu uma criatura capaz de algo muito útil: alimentar-se de CO2.

Exatamente como as plantas (que absorvem luz e CO2), mas com uma vantagem: a bactéria é mais eficiente, ou seja, se multiplica mais rápido e absorve mais CO2 do ar. "Agora podemos retirar o gás diretamente da atmosfera, sem ter de esperar as plantas crescerem", diz o bioquímico Michael Adams, autor do estudo. Seria possível criar usinas de absorção de CO2, que cultivariam o micróbio em grande escala, para frear o aquecimento global. Depois de comer o gás, ele excreta ácido 3-hidroxipropiônico - que serve para fazer acrílico e é um dos compostos mais usados na indústria química.

Se a bactéria transgênica escapar e se reproduzir de forma descontrolada, poderia consumir CO2 em excesso e esfriar demais a atmosfera. Existe um mecanismo de segurança natural contra isso: ela só consegue comer o gás se a temperatura for de 70 graus (que seria mantida artificialmente nas usinas). Mas sempre existe a possibilidade de que a bactéria sofra uma mutação, supere esse bloqueio - e mergulhe a Terra numa nova era glacial. Talvez seja melhor deixar as plantas cuidando do CO2.

Bioquímica - Aula 06 As Enzimas: I Parte

Neste Módulo

(1) Introdução

(2) Características das Enzimas 

(3) Uma pausa na físico-química 

Introdução 

Existem duas condições fundamentais para a vida. A primeira é a autorreplicação dos organismos vivos, a segunda a capacidade de catalisar reações químicas eficientes e seletivamente. Os catalisadores biológicos são conhecidos como enzimas, proteínas catalítica, especializada, aceleram a reação química, coordenam as vias metabólicas. Sua deficiência ou excesso pode causar doenças.  O primeiro passo para trabalharmos com as enzimas é entender os princípios fundamentais e sua forma de ação catalítica. Em seguida analisaremos a cinética química, reguladores enzimáticos.

Características Enzimáticas

As enzimas são estruturas que apresentam duas partes: apoenzimas ( parte protética) e cofatores ( substâncias inorgânicas ou orgânicas necessárias ao funcionamento das enzimas). Os cofatores dividem-se em três grupos:

(1) Íons cátions: Cu ²⁺, Fe²⁺ Fe ³⁺,K⁺, Mg²⁺, Mn⁺², Mo, Ni⁺², Se, Zn²⁺

(2) Orgânicos: conhecidos como coenzimas: As principais coenzimas são as vitaminas.

(2) Orgânicos: São os metalorgânicos ou  orgânicos que estão firmemente ou ate mesmo covalentemente ligados à parte proteica da enzima. Alguns exemplos de grupos prostéticos incluem o grupo heme da hemoglobina, derivados da vitaminas como tiamina, biotina, ácido lipoico. 

As enzimas classificadas em seis classes: transferases, hidrolases, liases, isomerases e ligases. Cada classe é subdividida de acordo com a reação que catalisa, por exemplo: as oxidorredutases são enzimas que catalisam reações de transferência de elétrons, ou seja: reações de oxi-redução. São as Desidrogenases e as Oxidases. Existem três métodos de nomenclatura para as enzimas, a recomendada é a sistemática e usual.

As enzimas são altamente específicas ao seu substrato. Com exceção da ribonuclease, todas as enzimas são proteínas. Sua atividade depende de sua integridade da sua conformação nativa. As estruturas proteicas primárias, secundárias, terciárias e quaternárias das enzimas são essenciais para a atividade catalítica.

Resumo:

·       Apresentam duas partes: apoenzimas e cofatores;

·       Classificadas em: oxidorredutase, hidrolases, liases, isomerases e ligase;

·       Altamente especificas; sua atividade depende da conformação nativa;

·       Catalisadores biológicos; aceleram a reação, diminui a energia de ativação, fazem parte das vias metabólicas;

·       Com exceção das ribonucleases, todas as enzimas são proteínas. 

Funcionamento Enzimático

        As enzimas são especificas a um ou vários substratos. Esta especificidade deve à existência, na superfície da enzima, de um local denominado sítio ativo. O sítio ativo é um arranjo tridimensional espacial dos aminoácidos de uma determinada região da enzima, complementar ao substrato. Quando o substrato liga-se ao sítio ativo, formando o complexo ES. Essa ligação afetará a velocidade da reação sem alterar o equilíbrio químico, uma vez que, diminui a berreira energética (energia de ativação) existente entre os estados fundamentais substrato/produto. 

        

Biologia Celular - Aula 01 -O mecanismo de comunicação celular

Bloco E. Fonte: Biologia molecular da célula. Bruce et al. 5 Edição. Este resumo não substitui a leitura completa do livro.

MAPA TEÓRICO

·       A molécula-sinal extracelular (MSE)

o   As MSE se ligam a receptores específicos.

o   As MSE podem agir a pequenas ou a grandes distâncias

o   Cada célula está programada para responder a combinações específicas de moléculas-sinais extracelulares

o   Diferentes tipos celulares respondem a diferentemente à mesma MSE

o   Morfógeno

o   Que ativam receptores intracelulares ( NO e esteróides)

o   As células podem usar múltiplos mecanismos para responder abruptamente a um aumento gradual na concentração de um MSE.

o   As células podem ajustar sua sensibilidade ao sinal

·       Os receptores

o    intracelular: receptores nucleares são proteínas reguladoras gênicas moduladas por ligação

o   Extracelular: Os receptores associados a: canais iônicos, proteína G e enzimas

·       As vias: Proteínas de sinalização intracelular (PSI)

o   A maioria dos receptores de superfície celular ativados transmite sinais por meio de pequenas moléculas e de uma rede de PSI

o   Muitas PSI atuam como comutadores moleculares que são ativados por fosforilação ou ligação ao GTP

o   Complexo de sinalização intracelular: conjunto de PSI, aumenta a velocidade, eficiência e especificidade da resposta.

o   Os domínios de ligação modulares: a interação com os PSI, As redes de sinalização intracelular: o circuito de retroalimentação

Vale ressaltar que, tanto o MSE, quanto receptores e vias trabalham em conjunto em uma célula, a divisão é apenas teórica para facilitar o entendimento do conteúdo.

1 - A MOLÉCULA-SINAL EXTRACELULAR

Parte I  

A comunicação célula-célula ocorre através da emissão e recepção de sinais moleculares que são recebidos por proteínas receptoras. Essas proteínas podem está localizadas na superfície extracelular ou intracelular aos quais as MSE se ligam. Esta ligação ativa o receptor da célula alvo e por conseguinte uma ou mais vias intracelulares mediadas por uma séria de Proteínas Sinalizadoras Intracelulares (PSI). Os PSI podem está associados formando complexos de sinalização como também unidos a domínios de ligações modulares. Finalmente, uma ou mais proteínas alteram a atividade de proteínas efetoras, alterando, assim, o comportamento da célula. Dependendo do sinal, do estado e da natureza da célula receptora, estes efetores podem ser, entre outros, proteínas reguladoras de genes, canais iônicos, componentes de ma via metabólica, ou partes do citoesqueleto (figura).

Palavras chaves: Moléculas-sinais, receptores, células-alvo, proteínas sinalizadoras intracelular e efetoras.

Parte II  

                                                                                                        

Existem diferentes tipos de molécula-sinal extracelular (MSE),formadas por proteínas, aminoácidos, nucleotídeos, esteroides, retinóis, derivados de ácido graxo, gases dissolvidos e principalmente pequenos peptídeos. Os sinais extracelulares tanto podem ser hidrofílicos quanto hidrofóbicas. Os hidrofílicos são incapazes de atravessar a Membrana da célula-alvo; logo se ligam a receptores de superfície, que por sua vez geram sinais no interior desta célula, os hidrofóbicas ou suficientemente pequenos conseguem difundir pela membrana e se ligarem a receptores intracelular na célula-alvo – no citosol ou núcleo. Uma vez no interior da célula, elas regulam diretamente a atividade de proteínas intracelulares específicas. Um importante exemplo é o óxido nítrico, que nos mamíferos, das muitas funções que exerce, relaxa a musculatura lisa dos vasos sanguíneos, outro exemplo citado pelo autor são os hormônios esteroides (testosterona), tireoides, gênicos, vitamina D e retinóis que se ligam a proteínas receptores intracelulares e alteram a capacidade de controlar a transcrição de genes específicos, sendo assim, reguladoras gênicas. Valem lembrar que, existem, também, reguladores gênicos produzidos por sinais oriundos de receptores da superfície da membrana através das proteínas de sinalização intracelular que ativam proteínas efetoras.

Os sinais  podem manter-se ligados ao receptores de forma permanente (mecanismo de memória celular) ou parcialmente, sendo estes removidos do receptor. A remoção dependerá, dentre outros fatores,  da velocidade de destruição ou reposição das moléculas afetadas por ela. Os MSEs podem ser liberadas por exocitose a partir das células sinalizadoras no espaço extracelular, difusão ou exposição na superfície externa da célula. As MSE, liberadas podem agir a pequena ou grande distância ( longa ou curta). Essa ação dependerá do tipo de célula sinalizadora (contato,parácrina, sináptica ou endócrina) que produz o sinal para a célula-alvo. A célula-alvo pode está em contado, próximo ou a longas distâncias. A sinalização por contato  requer que as células estejam em contato direto; membrana-membrana. Geralmente, esse tipo de sinalização,ocorre no desenvolvimento embrionário e respostas imunes. Já a sinalização a distância acontece quando as MSE são secretados para o fluido extracelular.

§  Célula de sinalização parácrina: os sinais atuam localmente sobre células alvo próximas.  Aqui as células sinalizadoras e alvo podem ser iguais ( câncer) ou diferentes. Para que os MSE ajam localmente, estes devem interagir com a matriz extracelular que diminui seu pontecial de difusão restringindo seu alcance.

·       Célula  de sinalização sináptica: desenvolveram ramificações (axônios), a fim de entrar em contato com a célula-alvo distante por intemédio dos neurotransmissores.

·       Célula  de sinalização endócrina: Suas MSE são os hormônios que são secretados na corrente sanguínea agindo em logas distâncias. 

Diferença entre a sinalização sináptica e endócrina 

     

Célula  de sinalização sináptica	-Lenta, pois é difundida pelo corrente sanguínea -Sinais muito diluídos, menor concentração -hormônios - dissociação baixa
Célula  de sinalização endócrina:	-Rápida, difusão por contato sináptico -Sinais menos diluídos, maior concentração -Mais precisa em relação ao tempo x espaço -neurotransmissores - dissociação rápida dos receptores

Observação: Existem mecanismos que permitem às células endócrinas e os neurônios coordenarem a longa distância o comportamento celular.

Observação 2: A função das junções ocludentes. Essas junção são definidas como canais aquosos estritos que conectam citoplasmas de células epiteliais adjacentes. Esta permite que informações sinalizadas seja compartilhadas pelas células vizinhas moléculas pequenas intracelular como: AMP cíclico, Cálcio entre outro. 

Exemplo de comunicação por junção; quando o nível de glicose está baixo no sangue, a noradrenalina estimula a sinapse em células hepatócitos que aumentam a concentração de AMP, que por sua vez estimula a quebra de glicogênio produzindo glicose livre.

Palavra-chave: Tipos de célula de sinalização, junção ocludente, MSE, célula-alvo. 

Parte III 

Cada tipo celular exibe um conjunto de receptores que tormam capazes de responder a um conjunto de MS produzidas por outras células. Essas moléculas regulam o comportamento celular trabalhando de forma coordenada. Essa diferenciação de conjuntos de resposta está ligado a característica específica de cada célula formada através do seu desenvolvimento de especialização celular. Por exemplo, muitas células epiteliais requerem sinais de sobrevivência da lâmina basal sobre a qual elas se acomodam; se perderem o contato com a lâmina da matriz, elas morrem por apoptose.

A combinações específicos de MSE podem obter as seguintes respostas:

§  Sobrevivência

§  Crescimento e divisão

§  Diferenciação

§  Morte por apoptose

Um mesmo MSE pode agir em diferentes tipos de células produzindo respostas diferentes ou um mesmo tipo de célula. Esse fato pode ser resumido abaixo:

(1) Um mesma MSE que atua sobre diferente tipos de células produz respostas diferentes. A acetil-colina produz respostas diferentes em células cardíacas e musculares, por exemplo, nas células cardíacas este sinal diminui a velocidade de contração, já no músculo, aumenta a velocidade. Este fato é explicado através das diferentes respostas intracelulares de cada célula.

(2) Um mesmo MSE que atua sobre o mesmo tipo de célula, pode ter, qualitativamente, diferentes efeitos dependendo da concentração do sinal. Essa resposta é importante para as células se diferenciarem. As MSE que atuam durante o desenvolvimento são chamadas de morfógeno. Essa diferença no gradiente de concentração leva a níveis diferentes de ativação de receptores que resultam em diferentes padrões de expressão gênica.

A velocidade de resposta depende:

§  Mecanismos de liberação do sinal x Natureza da resposta da célula-alvo

§  Aumenta a velocidade ( mudanças alostérica), Diminui a velocidade ( expressão gênica)

A resposta celular depende:

§  Conversão das proteínas sinalizadoras intracelulares passarem da forma inativa para ativa ou sua síntese-degradação

§  Tipos de receptores

§  Dos diferentes tipos de MS

§  Dissociação das Ms dos receptore e liberação

§  Exposição prolongada do estímulo reduz uma resposta, ou seja, alterações na concentração das MSE alteram a respota. 

2 – OS RECEPTORES

Os receptores podem ser de superfície celular como intracelulares. Os receptores são proteínas  formada por regiões, sendo uma delas com um domínio de interação com o ligante. Os receptores intracelular que altera a capacidade de controlar a transcrição de genes específico são chamados de nucleares. Os receptores nucleares tanto podem ser regulados por metabólitos intracelulares ( mamíferos) como por moléculas-sinal secretadas. Alguns destes receptores estão localizados no citosol, outros ligados ao DNA no núcleo. A superfamília dos receptores nucleares apresentam uma estrutura semelhante. Possuem duas formas: inativa(geralmente ligado a um inibidor) e ativa. As proteínas receptoras nucleares estão, às vezes, presentes também na superfície da célula, onde atuam por mecanismos diferentes dos quando no citosol ou núcleo. Existe também os receptores de superfície celular que convertem sinais extracelulares em intracelulares,  no processo chamado de transdução de sinal. Estes receptores podem está associados ou não a proteínas ( G, enzimas, sinalizadoras intracelulares), canais iônicos. 

Parte IV   

                                                                

A maioria das proteínas receptoras de superfície celular pertence a três classes, definidas por seu mecanismo de transdução, são eles: associados a canais iônicos, à proteína G e a enzimas. Falaremos brevemente sobre eles:

(A) Receptores associado a canais iônicos: envolvidos na sinalização sináptica rápida entre células nervosas e célula-alvo mediado por neurotransmissores que forma proteínas que interagem com o receptor presente no canal fazendo com que este abra ou feche, temporariamente. 

(B) Receptores associados à proteína G: todos os eucariontes usam receptores associados a proteínas G ( GPCRs). Estes forma a maior família de receptores na superfície da célula e mediam a maioria dos sinais extracelulares, bem como os sinais de outras células como hormônios, neurotransmissores e mediadores locais. Apresentam estrutura semelhante que consiste em única cadeia polipeptídica que atravessa sete vezes a bicamada lipídica. A ligação entre a MSE e o GPCRs provoca mudança conformacional no receptor, que por conseguinte, ativa a proteína G. Esta proteína G pode está ligada à face citoplasmática da membrana, acoplada funcionalmente e fisicamente ao receptor, a enzimas ou canais iônicos da membrana. Existem vários tipos de proteína G, cada uma específica para um conjunto particular de receptor associados e para um conjunto particular de proteínas alvos na M.P (Membrana Plasmática). As proteínas G triméricas são formadas por três subunidades; alfa, beta e gama. A subunidade alfa quando não estimulada apresenta GDP ligada, quando ativada, esta sofre hidrolise liberando o GDP para substituir por GTP. Logo, a unidade alfa é responsável pela ativação das proteínas G. Algumas proteínas G regulam a produção de AMP cíclico, por exemplo, A proteína-cinase depende de AMP cíclico sendo mediadas pela PKA. Os GPCRs ativam várias vias de sinalização intracelular, uma delas é a via adenilil-cicalse. Essa via aumenta a quantidade de Gs que aumenta a concentração de cAMP no citosol, que por sua vez, ativa PKA, e suas subunidades catalíticas liberadas entram no núcleo( proteínas efetoras – sinalização intracelular), onde fosforizam a proteína reguladora que estimulam a transcrição gênica(elemento de resposta ao cAMP). Está via controla muitos processos celulares, desde a síntese de hormônio pelas células endócrinas a produção de proteínas necessária à indução de memória de longa duração.

As proteínas G ativam:           

§  Enzimas ( adenili-ciclase)

§  Canais iônicos ( aumentando à concentração de cálcio)

§  Permeabilidade da membrana ou canal, Algumas de forma direta outras indireta pela estimulação da fosforilação dos canais ( PKA..)      

     

(C). Receptores associados a enzimas: Os receptores associados a enzimas (RAE) são proteínas transmembranar com um domínio de interação localizado tanto na superfície externa da MP como no citosol, associam-se diretamente a uma enzima, ou apresentando atividade enzimática intrínseca. Enquanto as GPCRs possuem sete segmentos os cada subunidade do RAE  possuem apenas um segmento. Algumas vias de sinalização podem tanto ser ativados por uma ou dois segmentos

No livro, veremos exemplos de várias proteínas sinalizadoras intracelures ou receptores adjacentes ligadas as subunidade: As ligadas às tirosinas fosforiladas, as proteínas adaptadora (Drk), efexina, PI 3 cínase, STAT 1,  JAKS, Receptor tipo I, entre outros.

Existem seis classes de receptores associados a enzimas:

·       Tirosina-cinase: fosforilam tírosinas específicas próprias e em um pequeno grupo de proteínas sinalizadoras intracelulares

·       Associados à tirosina-cinase: n têm atividade enzimática intrínseca, mas recrutam, diretamente, proteínas tirosina-cinases citoplasmática para transmitir o sinal

·       Serinatreonina-cinase: fosforilam serinas ou treoninas específicas próprias e em proteínas reguladoras gênicas latente, com as quais associam.

·       Associados à histamina-cinase: ativam uma via de sinalizacao de dois componentes na qual a cinase fosforila suas protepias histidinas e transfere o fosfato imediatamente para uma segunda proteína sinalizadora intracelular.

·       Guantili-ciclase catalisam, diretamente, a produção de GMP cíclico

·       Tirosina-fosfatases: similares a receptor removem grupos fosfato de tirosinas de proteínas sinalizadoras intracelulares específicas

A classe de receptores tirosina-cinases

Muitas proteínas-sinal extracelulares atuam via receptores tirosina cinases (RTKs tirosina-cinase. Eles geralmente, atuam nas vias de crescimento, formado por subfamílias), que apresentam um domínio externo rico em cisteína e internamente: receptor EpH que tem como ligante a efrina, os NGF, EGF, de insulina, entre outros. Sua ação ocorre quando as tirosinas fosforiladas no receptores servem como sítios de ancoragem para proteínas de sinalização intracelular. 

Logo, as mais diferentes proteínas sinalizadoras intracelulares podem se ligar às fosfatidilserinas dos cistinas de RTKs ativados ou nas ancoradas ao receptor. Um exemplo interessante é a ativação da ancora PI 3-Cinase, esta cinase fosforila principalmente fosfolipídeos de inositol gerando os chamados fosfoinositídeos. A produção dos fosfoinositídeos servirão de sítio de ancoragem para várias proteínas de sinalização intracelular.(figura), elas tem função central na promoção da sobrevivência celular e crescimento. Para que um organismo multicelular cresça, suas células devem crescer(acumular massa e aumentar o tamanho). Se as células simplesmente se dividirem sem crescimento, elas ficarão progressivamente menores, e o organismo como um todo permanecerá do mesmo tamanho. Sinais extracelulares são requeridos para as células cresçam e se dividam, além de sobreviverem. Assim, alguns fatores de crescimento estimulam o desenvolvimento e sobrevivência de muitos tipos de células animais. Esse fatores se ligam aos RTKs, os quais ativam a PI 3-cinase para produzir fosfoinositídeos PI( 3,4,5)P3 ou PIP3. Os PIP3 recrutam duas proteínas cinase para a membrana plasmática via PH-Akt. As Akt são ativadas que fosforila várias proteínas alvo na MP, citosol e núcleo. O efeito observado na maioria dos alvos é sua inativação cooperando assim com a sobrevivência celular. Quando a Akt fosforila uma proteína conhecida como bad, ela inativa-se, contudo, seu estado não fosforilado, provoca a morte celular por apoptose.

Um exemplo que também pode ser citado dentro desta classe de receptores são os q recebem sinais de citocinas ativando vias de sinalização JAK-STAT. Os receptores de citocinas estão associados, de forma estável, a uma classe de tirosina-cinase citoplasmática denominada de JAKS, elas ativam proteínas reguladoras gênicas chamadas de STAtS. Essa proteínas estão localizam-se no citosol e são referidas como proteínas reguladoras gênicas latente porque migram para o núcleo e regulam a transcrição somente após serem ativadas. A ligação da citosina altera a organização, causando a aproximação de duas JAKs para que possam fazer transfosforilação, aumentando, assim, a atividade de seus domínios de tirosina-cinase.Elas fosforilam as tirosinas dos receptores de citocinas, criando sítios para a ancoragem do STATs. São conhecidas, pelo menos, 6 STATs nos mamíferos. Dentre sua resposta estão: ativação dos macrófagos, aumenta da resistência celular frente a infecção, produção de leite, eritrócitos entre outros 

AS VIAS: PROTEÍNAS DE SINALIZAÇÃO INTRACELULAR (PSI)

Os PSIs são moléculas de sinalização intracelular ativadas em resposta aos sinais que se ligam a receptores associados a proteína G ou enzimas na superfície celular. Os PSI atuam em proteínas alvos que serão responsável pela mudança comportamental celular.

Algumas das funções das PSI

1- transmissão: transmitir a mensagem para o próximo componente da cadeia de sinalização

2- suporte: reunir duas ou mais PSI para que possam interagir

3- amplificar; o sinal que recebe produzindo grandes quantidades de mediadores intracelulares ou ativar várias cópias de uma proteína sinalizadora, provocando uma reposta ampla ou cascata de sinalização.

4- transduzir: o sinal que recebe, de forma diferente

5- propagar o sinal a partid de PSI secundários

6- ancorar as PSI

7- modular a atividade de outras PSI, regulação sua ação. 

PARTE V

As PSIs utizam algumas estratégias no processamento do sinal:

(1) comutação= muitas PSI passam de conformação inativa para ativa, fênomeno conhecido como comutadores moleculares. Exemplo: os comutadores moleculares que são ativados inativados por fosforilação ( adição ou remoção do grupo fosfato) através das protínas cinase e fosfatase

(2) Detectores de coincidência= os sinais A e B ativam diferentes vias de sinalização intracelular, que levam à fosforilação de diferentes sítios da proteína Y. Está é ativada somente quando ambos os sítios forem fosforilados, ou seja, é ativada somente usando os sinais A e  B estiverem presentes simultaneamente.

(3) Os complexos de sinalização intracelular = formado pelo receptor e vários PSI unidos por diferentes mecanismos, seja através das proteínas de suporte, seja através de um ou mais receptores, seja por proteínas G. Os complexos aumentam a velocidade, eficiência e especiicidade da resposta. Os complexos são formados quando um MSE ativa múltiplas vias de PSI paralelas. Eles podem ser montados tanto no receptor quando em proteínas ancoradas. 

(4)Domínios de ligação modulares = quando os PSIs estão reunidos, sua proximidade ativa-os, fenômeno que recebe o nome de proximidade induzida, na qual um sinal desencadeia a montagem é utilizado na transmissão entre as proteínas. Entretanto, Os domínios de interação permitem que as proteínas se liguem umas às outras em combinações múltiplas. os domínios de interações podem ser uma sequência petídica curtas, altamente conservada, modificações covalentes, entre outras, estes domínios unem PSIs de diferentes tipos possibilitando novas vias de sinalização. Logo a inserção em qualquer local na PSI de um novo domínio preexistente possibilita novas vias. Algumas PSIs possuem apenas dois, ou mais domínios de interação e funcionam somente como adaptadores para reunir duas ou mais proteínas em uma via.

(5) As redes de sinalização intracelular utilizam circuitos de retroalimentação = os produtos da PSI atuam na retroalimentação negativa ou positiva. São muito importantes, pois regulam muitos processos químicos e físicos na célula.